МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР
ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Начальник Главного
санитарно-
эпидимиологического
управления,
Министерства
здравоохранения СССР
В.Е.Ковшило
11.01.1979 N 1959-79
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ
И КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ
N-НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Выборочный лабораторный контроль за содержанием в пище
канцерогенных, токсичных и других чужеродных веществ является
одной из главных задач гигиены питания.
Среди канцерогенов имеются соединения, образующие в пищевых
продуктах в естественных условиях технологической обработки и
хранения. К таким соединениям относятся N-нитрозамины (НА),
обладающие высокой канцерогенной активностью. Канцерогенность НА
доказана на лабораторных животных, причем эффект проявляется при
действии черезвычайно низких доз НА порядка 0,075 мг/кг веса тела.
Кроме, того НА обладают мутагенными свойствами, а некоторые
из них - достаточно высокой токсичностью.
В отличие от других химических канцерогенов НА представляют
собой простые по химической структуре соединения общей формулы
R1\\
= N-NO .
R2/
НА относительно стабильные вещества, хорошо растворимые во
многих органических растворителях (хлористый метилен, хлороформ,
эфир и др.) и умеренно в воде. Многие НА, в частности,
N-нитрозодиметиламин (НДМА), N-нитрозодиэтиламин (НДЭА),
N-нитрозодипропиламин (НДПА), N-нитрозодибутиламин (НДБА),
N-нитрозопирролидин (НПир) и N-нитрозопиперидин (НПип) обладают
высокой летучестью с водяным паром (летучие НА).
НА способны легко оборазовываться из предшественников -
нитритов или нитратов и аминов или других веществ, содержащих
аминогруппу. Нитриты содержатся в растениях, почве, природных
водах. В этих же объектах, но в значительно больших концентрациях,
имеются нитраты, которые с помощью бактерий и ферментов могут
восстанавливаться в нитриты. Кроме того, нитриты и нитраты
вносятся в пищевые продукты в процессе технологической обработки
(копчение, соление, консервирование и др.) для фиксации цвета,
увеличения срока хранения и улучшения запаха.
В ряде пищевых продуктов, особенно рыбных и мясных,
содержится значительное количество аминов, которые являются
промежуточными веществами метаболизма белков. Вследствие этого НА
могут образовываться в пищевых продуктах в побочных условиях
технологической обработки и хранения.
В плане профилактики заболеваний элиментарного происхождения
важнейшее значение приобретает проведение санитарно-гигиенических
исследований с целью обнаружения НА в пищевых прдуктах.
Отсутствие унифицированных надежных методов анализа
микроколичеств НА затрудняет сопоставление полученных результатов
и является одной из причин большого разброса опубликованных данных
количественного анализа.
В пищевых продуктах в основном обнаружены НДМА, НДЭА, НПип, а
в отдельных случаях также НПир, НДБА и др. Материалы,
характеризующие содержание летучих НА в некоторых отечественных и
зарубежных пищевых продуктах приведены в таблице.
В Институте питания АМН СССР в последние годы ведутся
систематические исследования по разработке методов обнаружения,
идентификации и количественного определения НА, а также по
изучению содержания НА в отечественных пищевых продуктах.
В результате проведенных исследований для серийных анализов
разработан относительно простой и быстрый метод определения
летучих НА в различных видах пищевых продуктов, основанный на
денитрозировании НА, получении флуоресцирующих и окрашенных
производных взаимодействием образовавшихся вторичных аминов с
7-хлор-4-нитробензо-2-окса-I,3-диазолом (НБД-хлоридом) и
визуальном сравнении на хроматографической пластинке
интенсивностей флуоресценции и окрасок стандартных, опытных и
котрольных (отличающихся от опытных только отсутсвием НА) проб.
При необходимости возможно также точное количественное
определение НА путем элюирования соответствующих зон и
флуриментрирования.
К выгодным особенностям метода относяться простота выделения
НА из пищевых продуктов, значительное упрощение очистки
экстрактов, оценка содержания НА непосредственно на
хроматографической пластинке.
Важным преимуществом метода является возможность
использования в качестве стандартов на самих НА, а соответствующих
вторичных аминов.
Предел обнаружения в расчете на НА составляет в УФ-свете
1-5 нг, а в видимом свете 10-30 нг в пятне. Различные окраски
пятен (желтая, оранжевая, розовая) могут быть использованы для
дополнительной идентификации НА.
Метод позволяет надежно определять НА в любых пищевых
продуктах при содержании 1 мкг/кг ивыше. Следует подчеркнуть, что
все испытательные результаты определения подтверждаются
хромато-масс-спектрометрически.
Результаты сравнительного анализа ряда мясных, рыбных,
молочных и овощных продуктов хромато-масс-спекрометрическим,
флуориметрическим и предлагаемым нами методами близки.
Воспроизводимость предлагаемого метода относительно мало
отличается от воспроизводимости хромато-масс-спекрометрического
метода (коэффициент корреляции составляет 0,2-0,4 и 0,15-0,25
соответсвенно).
Продолжительность определения - 3 часа; один аналитик за
рабочий день может провести 7-8 анализов.
В настоящий "Методических рекомендациях" описаны общие
методические приемы проведения серийных определений НА в пищевых
прдуктах и рекомендованы необходимая аппаратура и реактивы.
МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА
Оборудование и материалы
1. Парообразователь.
2. Колба круглодонная с длинным горлом на 1000 мл с
нормальным шлифом НШ N 29 по ТУ 48-52.
3. Колба плоскодонная на 100 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52.
4. Холодильник прямой с НШ N 14,5 с алонием по ГОСТ 9499-70.
5. Цилиндры мерые вместимостью 250, 100 и 50 мл по
ГОСТ 1770-74.
6. Плитки электрические.
7. Весы технические по ГОСТ 19491-74.
8. Делительная воронка вместимостью 250 мл по ГОСТ 8613-75.
9. Колба для упаривания на 50 мл с НШ N 14,5 по
ГОСТ 10394-72.
10. Дефлегматорная насадка по ГОСТ 20789-75.
11. Ротационный испаритель с ловушкой по МРТУ 42-2589-66.
12. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.
13. Баня водяная по ТУ 64-1-423-72.
14. Пипетка на 1 и 2 мл по ГОСТ 20292-74.
15. Термометр 0-100 град.C по ГОСТ 2045-71.
16. Чашки фарфоровые выпарительные, диаметр 50 мм по
ГОСТ 9147-73.
17. Микропипетки на 0,1 мл по ГОСТ 1770-74.
18. Пробирки на 5 мл с НШ N 14,5 с притертыми пробками по
ГОСТ 10515-7.
19. Шкаф сушильный (типа МРТУ 42-1411-61).
20. Микрошприц МШ-10 или калиброванный капилляр.
21. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе
(модель ВЗЗ МРТУ 64-1-1080-63) или ртутно-кварцевая лампа (типа
ПРI-4) с фильтром, прпускающим область 360 км (типа УФС-6).
22. Камера для ТСХ с притертой крышкой, например, стеклянный
четырехугольный сосуд 195х195х200 мм завода "Дружная горка".
23. * * * пластинки стеклянные 9х12 см с нанесенным слоем
силикагеля КСК 0,25-0,5 мм для ТСХ (СССР).
24. Натрий сернокислый по 4166-76 хч.
25. Серная кислота по ГОСТ 14252-69 хч 8 н (22 мл H2SO4
плотностью 1,84 разбавляют 78 мл дистиллированной воды).
26. Сульфаниловая кислота по ГОСТ 5821-69.
27. Уксусная кислота ледяная по ГОСТ 61-75 или 18270-72.
28. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
29. Натрий углекислый по ГОСТ 8363 хч.
30. Едкий натрий по ГОСТ 4328-66 хч или 11078-71.
31. Эфир диэтиловый медицинский или ГОСТ 6265-52.
32. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76.
33. Бромистоводородная кислота конц. по ГОСТ 2062-67;
3% раствор бромистоводородной кислоты в ледяной уксусной кислоте
(1,4 мл HBr разбавить 18,6 мл уксусной кислоты).
34. 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол (НБД-хлорид);
раствор в 0,2 мг/мл в изопропиловом спирте.
35. Спирт изопропиловый ГОСТ 5.595-70.
36. Натрий кислый углекислый по ГОСТ 4143-69; 1% раствор в
дистиллированной воде.
37. Диметиламин по ТУ 6-09-1426-71 хч.
38. Диетиламин по ТУ 6-09-68-70 хч.
39. Дибутиламин по ТУ 6-09-1802-72 хч.
40. Пиперидин по МРТУ 6-09-6855-69 хч.
41. Пироллидин * * *.
42. Соляная кислота конц. по ГОСТ 3118-67 или 14261-69;
водный раствор 0,5 мг/мл.
43. Этилацетат по ГОСТ 5.1070-71 хч.
44. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51 хч.
45. Бензол по ГОСТ 5955-75 хч.
1. Выделение НА из пищевых продуктов.
Схема установки для выделения НА перегонкой с водяным паром
приведена на рис.1 ( va959400-79 ). До начала перегонки воду в
парообразователе нагревают до кипячения.
В круглодонную колбу помещают 100-120 г мелко измельченного
образца продукта, заливают раствором 80 г сульфата натрия, 1 г
сульфаниловой кислоты и 10 мл уксусной кислоты в 200 мл воды,
перемешивают 5 мин. добавляют 8 г серной кислоты. Затем колбу
устанавливают в прибор для перегонки с водяным паром, подогревают
ее содержимое до начала кипения и начинают перегонку. Перегонку
проводят до тех пор, пока объем дистиллята не достигнет 100 мл.
2. Экстракция НА и концентрирование экстракта.
В дистилляте (100 мл) растворяют 3 г едкого натрия и 20 г
углекислого натрия, охлаждают и экстрагируют НА 60 мл эфира. Слои
разделяют, водный слой повторно экстрагируют 60 мл эфира. Эфирные
экстракты объединяют, сушат 3-4 г сульфата натрия (безводного) и
коцентрируют в колбе для упаривания (частями) на ротационном
испарителе при температуре 30-35 град.С с дефлегматорной насадкой
до 0,4 мл.
Схема установки для упаривания приведена на
рис.2 ( va959400-79 ).
Дефлегматорную насадку промывают 0,3 мл уксусной кислотй.
3. Денитрозирование НА и получение производных.
К концентрату добавляют 0,4 мл 3% бромистоводородной кислоты
в ледяной уксусной кислоте; смесь делят на две равные части (опыт
и контроль), помещают в фарфоровые чашки и осторожно упаривают при
перемешивании на плитке с асбестовой сеткой досуха. В одну из
чашек (контроль) добавляют 0,5 мл 0,2% раствора углекислого
натрия, перемешивают и упаривают досуха. После охлаждения в обе
чашки приливают по 0,45 мл раствора НБД-хлорида, тщательно
перемешивают стеклянной палочкой и сливают в пробирки. В пробирки
добавляют по 0,05 мл раствора кислого углекислого натрия,
перемешивают, закрывают пробками и выдерживают в сушильном шкафу
при темпиратуре 65+,-5 град.С в течение часа.
Приготовление стандартов. Исходный раствор (I): навески
диметиламина - 0,61 г (с учетом процентного содержания в
растворе), диэтиламина - 0,72 г, пиперидина - 0,75, пироллидина -
0,71 г и дибутиламина - 0,82 г количественно переносят в мерную
колбу на 1 л и доводят до метки раствором соляной кислоты в воде.
Концентация аминов в исходном растворе эквывалентна содержанию
соответствующих НА 1 мг/мл.
При приготовлении исходного раствора допускается
использование вместо навесок точно отмеренных объемов: диметиламин
- с учетом процентной концентрации раствора, диэтиламин - 0,51 мл,
пиперидин - 0,64 мл, пироллидин - 0,61 мл, дибутиламин - 0,60 мл.
В зависимости от поставленной задачи номенклатура аминов в
исходном растворе может варьироваться, в частности, соответвующие
редко встречающимся в отечественных продуктах НПир и НДБА амины
могут быть опущены.
Эталонный раствор II готовят разбавлением раствора I в 10 раз
(0,1 мг/мл в расчете на НА);
эталонный раствор III готовят разбавлением раствора II в 2
раза (0,05 мг/мл в расчете на НА);
эталонный раствор IV готовят разбавлением раствора III в 5
раз (0,01 мг/мл в расчете на НА).
В три пробирки наливают по 0,45 мл раствора НБД-хлорида, по
5 мкл эталонных растворов II, III и IV и по 0,05 мл раствора
кислого углекислого натрия и выдерживают при 65+,-5 град.С вместе
с опытными и контрольными пробами. Содержание аминов в стандартах
в пересчете на НА составляет 1, 0,5 и 0,1 мг/мкл соответсвенно.
Все стандартные растворы хранят в холодильнике в герметичных
стеклянных сосудах. Срок годности исходного раствора до з месяцев,
а эталонных растворов - до 15 дней.
4. ТСХ разделение, идентификация и определение
содержания НА в исследуемом образце.
На пластинку на линию старта (1,5-2,0 см от края пластинки)
наносят по 10-20 мкл опытных, конрольных и стандартных образцов,
таким образом, чтобы расстояние между пятнами было не менее 1 см,
а от краев пластинки 1,5-2 см. Пластинку подсушивают на воздухе,
помещают в камеру, в которую предварительно заливают смесь
хлороформ-бензол-этилацетат-уксусная кислота 18:10:3:0,5, с таким
расчетом, чтобы высота слоя жидкости не превышала 1 см и закрывают
крышкой. Хроматографию заканчивают, когда фронт растворителя
достигнет заранее отмеченной высоты (1-2 см от верхнего края
пластинки). Длина пробега растворителя должна быть не менее
9-10 см. Пластинку вынимают, подсушивают на воздухе, рассматривают
в видимом свете, а затем в темной комнате в УФ свете. Сравнивают
интенсивности окрасок и флуоресценции стандартных, опытных и
контрольных пятен с одинаковыми значениями Rf.
Содержание НА в прдукте рассчитывают по формуле:
К х n
С = 1000 ----- , где
V х M
С - содержание НА в продукте в мкг/кг;
n - содержание НА в пятне в мг;
V - объем пробы, нанесенный на пластину в мкл;
М - масса образца, взятая для анализа в г;
К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения НА из пищевых
продуктов в разных НДМА - 1,28; НДЭА - 1,16; НДБА - 1,20; НПип -
1,49; НПир - 1,40.
В случае необходимости точного количественного определения НА
в пищевых продуктах, пятна опытных, контрольных и стандартных
образцов с одинаковым значениями Rf соскребывает с пластинки,
элюируют бензолом, центрифугируют элюаты и измеряют их
флуоресценцию при лямбда возбуждении = 470 нм и лямбда
флуоресценции = 520 нм.
Как правило, при измерении флуоресценции используют один
стандарт, наиболее близкий к опыту.
При флуориметрическом определении содержание НА в продукте
рассчитывают по формуле:
К х N [Hоп. - Нконтр.]
С = 1000 х ---------------------- х (мкг/кг), где
Нст. х V х М
N - количество НА (рассчитаное) в элюате пятна стандарта в нг;
Нст., Ноп. и Нконтр. - показания прибора при измерении
интенсивности флуоресценции элюатов пятен стандарта, опыта и
контроля в относительных единицах;
V - объем пробы, нанесенный на пластину в мкл;
М - масса образца, взятая для анализов в г;
К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения НА из пищевых
продуктов и равных для НДМА - 1,28; НДЭА - 1,16; НДБА - 1,20;
НПип - 1,49; НПир - 1,40.
Таблица
Материалы, характеризующие содержание НА
в ряде отечественных и зарубежных продуктов в мгк/кг
----------------------------------------------------------------------------
|Продукты |НДМА |НДЭА |НПип |Летуч.НА| НДМА |НДЭА |НДБА |НПир | НПип |
| |--------------------------+--------------------------------|
| | отечественные данные | зарубежные данные |
|--------------+--------------------------+--------------------------------|
|мясо свежее | | |
|и свежеморо- | не обнаружено | не обнаружено |
|женное | | |
|--------------+--------------------------+--------------------------------|
|мясо жаренное | | | | | 0-4 | 0-4 |0-1,1|0-19 | 0-8 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|мясо копченое | | | | | 0-8 | 0-7 |0-1 |0-1 | 0-2 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|сосиски |0-5,6|0-2,3|0-1,7| | 0-84 | 0-7 | |0-40 | 0-50 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|колбасы | | | | | | | | | |
|варенные, | | | | | | | | | |
|(чайнная,отде-| | | | | | | | | |
|льная,докторс-| | | | | | | | | |
|кая и др.) |0-5,4|0-6,1|0-2,6| | | | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|хлеб мясной |0-3,9|0-2,9|0-2,0| | 0-12 | 0-16 | |0-18 |0-50 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|колбасы полу- | | | | | | | | | |
|копченые (кра-| | | | | | | | | |
|ковская,украи-| | | | | | | | | |
|ская и др.) |0-13 |0-5,2|0-3,8| | | | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|колбасы | | | | | | | | | |
|свинные |0-12 |0-11 |0-58 | | 0-15 | 0-5 | |0-33 | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|колбасы свин- | | | | | | | | | |
|ные со специя-| | | | | | | | | |
|ми | | | | | 0-80 | | |0-80 |0-1600|
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|колбасы сыро- | | | | | | | | | |
|капченые (там-| | | | | | | | | |
|бовская, сове-| | | | | | | | | |
|тская,салями) |0-5,5|0-5,1|0-3,7| | 0-80 |0-0,3 |0-3,9|0-4,3|0-0,4 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|ветчина, | | | | | | | | | |
|окорок |0-2,6|0-1,5|0-2,4| | 0-6 |0-2,8 |0-0,7|0-20 |0-12 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|бекон | | | | | 0-30 |0-13 | |0-40 | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|бекон жареный | | | | | 0-30 |0-4,3 |0-1,5|0-207|0-8,2 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|консервы | | | | | | | | | |
|мясные | | | | | 0-45 | | |0-105|0-60 |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|рыба свежая | | | | 0-5 | 0-9 |0-4 | |0-3 | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|рыба жареная и| | | | | | | | | |
|печеная | | | | 0-10 | 0-18 |следы | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|рыба холодного| | | | | | | | | |
|копчения |0-4 |0-2 | | 0-54 | 0-22 | | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|рыба горячего | | | | | | | | | |
|копчения |0-22 |0-4 | | 0-75 | 0-10 | | |0-4 | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|консервы | | | | | | | | | |
|рыбные | | | | 0-12 | 0-25 | | |0-3 | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|рыбная мука | | | | |5-2000|0-36 | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|икра черная | | | | 0-10 | | | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|морские про- | | | | | | | | | |
|дукты (кревет-| | | | | | | | | |
|ки,гребешок и | | | | | | | | | |
|др.) | | | | | 0-12 | | |0-37 | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|молоко | не обнаружено | 0-3 | | | | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|сыры разные |0-3 |0-2 | | | 0-4 |0-2 | |0-1 | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|зерновые | не обнаружено | | | | | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
| | | | | 0-2 | | | | | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|фрукты разные | не обнаружено | | | | | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|яблоки |0-1 | | | | 0-2 | | | | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|овощи свежие | | | | | | |
|и вареные | не обнаружено | | | | | |
|--------------+--------------------------+------+------+-----+-----+------|
|свекла после | | | | | | | | | |
|хранения |0-1,5| | | | 0-5 | | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|шпинат после | | | | | | | | | |
|хранения | | | | |0-500 |0-100 | |0-5 | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|бобы соевые | | | | | 0-20 | 0-19 | | | |
|--------------+-----+-----+-----+--------+------+------+-----+-----+------|
|соления | | | | | 0-63 | | |0-19 | |
----------------------------------------------------------------------------